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想选择合适的二抗就必须会这些常识!
  • 发布日期:2019-07-25      浏览次数:52
    •      想选择合适的二抗就必须会这些常识!
          二抗是指用于靶向结合一抗的抗体。在多种免疫印迹、ELISA以及免疫荧光等免疫实验中,二抗经常和一抗结合使用以检测目标蛋白。很多二抗都带有标记物,例如AlexaFluor荧光染料或辣根过氧化物酶(HRP),从而使二抗的信号可以被检测到。
          实验中也可以使用带有标记物的一抗,但是二抗有很多优点。无论是使用哪种一抗进行检测,使用二抗可便于更换不同的标记物。例如,同样的一抗可以与HRP标记二抗一起用于免疫印迹,也可以与另一种AlexaFluor488荧光标记二抗一起用于免疫荧光实验。
          另外,二抗结合在抗原位置的标记染料比直标一抗要多,从而增强检测信号。使用二抗可以避免对一抗进行复杂且昂贵的化学标记(偶联),而且偶联反应(具有氨基酸特异性)可能干扰一抗对抗原的识别。
          选择合适的二抗
          要选择出一种最适用于您的应用和研究的最佳二抗,建议考虑以下因素:
          种属来源和种属反应性;特异性反应;纯化方法;交叉吸附;多重检测能力;抗体类型和亚型;完整抗体还是抗体片段;标记物;生物素结合蛋白。
          01    种属来源和种属反应性
          种属(Host)来源是指制备这种二抗的物种。常见种属来源包括鸡、驴、山羊、小鼠、兔、大鼠以及绵羊。因大多数一抗是在小鼠或兔的体内制备的,山羊来源的抗鼠、抗兔IgG二抗是最广泛的商业化二抗。
          注意:所用二抗的种属来源必须不同于一抗的种属来源和反应种属。例如,如果一抗来源于兔,则不能使用来源于兔的二抗。
          02    特异性反应
          区别于一抗的特异性概念(一抗只识别目标蛋白),二抗的特异性指针对一抗的反应特异性,其不仅包括特异识别目标物种(一般经交叉吸附),还包括特异识别目标免疫球蛋白(Ig)的类型或亚型,以及该二抗是否和抗体的特定部分结合。
          常识:如果一抗使用兔多抗,则需要使用抗兔二抗。如果一抗是鼠IgG2b,则二抗需特异识别该亚型。
          03    纯化方法
          动物血清或腹水一般经四种常见纯化方法:亲和纯化、特异性纯化、层析法、脱盐法。大多数Invitrogen二抗经过亲和纯化(protein A或protein G),纯化后抗体纯度能达到95%以上。特异性纯化是将抗原固定后进行纯化的方法,可以保证抗体纯度和特异性更高,大多数Invitrogen流式应用的二抗都经过此方法纯化。
          04    交叉吸附(Cross-Adsorbed)
          对二抗进行交叉吸附可以帮助去除来源于非目标抗体和蛋白的交叉反应性,从而提高抗体的特异性。交叉吸附是指将亲和纯化的二抗通过一个固定有其它种属来源的抗体或血清蛋白的纯化柱。能够识别这些其它种属来源的抗体或血清蛋白的二抗将结合在纯化柱上,通过这种方法可以获得交叉反应性更低的二抗,从而降低背景和提升抗体效价。
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